BOLETIM DA SOCIEDADE DE REUMATOLOGIA DO RIO DE JANEIRO

PADRONIZAÇÃO DO LAUDO DO FAN NO BRASIL
Roger Abramino Levy
(pelos participantes do I Consenso)
*Professor adjunto de Reumatologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (FCM-Uerj); diretor científico do Laboratório Labs Patologia Clínica e Investigação Laboratorial da Rede D'Or.


Introdução: O fenômeno LE, ou célula LE (Figura 1), foi descrito por Hargraves, em 1948, sendo, por muitos anos, utilizado como um marcador sorológico para o diagnóstico do lúpus eritematoso sistêmico (LES).

A técnica é trabalhosa, demorada e de difíceis realização e interpretação, o que contribui para fazê-lo um teste obsoleto. Já nos anos 60, observou-se que o teste para célula LE não era específico para o diagnóstico de LES, além do que apresentava menor sensibilidade do que a reação de imunofluorescência indireta utilizando substrato antigênico de imprint de tecido hepático de roedores (Figura 2). Logo ficou evidente que não eram somente pacientes com LES que apresentavam o teste de FAN reagente, visto que outras doenças auto-imunes, que acometem o tecido conjuntivo (esclerose sistêmica, poliderma-tomio-site, doença mista do tecido conjuntivo [DMTC], entre outras) (Quadro 1), também podem apresentá-lo.1

O desenvolvimento de novas metodologias de precipitação em gel e imunoensaios tornou possível a identificação de algumas proteínas que eram reconhecidas pelos FAN(s), sendo que estas passaram a ser associadas com os padrões específicos de imunofluorescência a elas relacionados.2

A pesquisa do FAN se constitui, ainda hoje, em um teste de triagem e, como tal, possibilita dar início à investigação laboratorial da pesquisa de auto-anticorpos. O substrato antigênico composto de células da linhagem HEp-2 representa uma população celular em vários estádios de maturação. Cada um deles (interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase) pode ser um fenótipo da expressão de uma série de genes, que, por sua vez, possibilitam a síntese de uma série de proteínas que surgem, reagem e atuam possibilitando a divisão celular e, então, desaparecem. A utilização das células HEp-2 como substrato tornou possível identificar o anticorpo anticentrômero (que cora o centrômero de células em divisão), encontrado em um subgrupo de pacientes com esclerose sistêmica, a chamada forma CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, esôfago com disfagia, esclerodactilia e telangiec-tasias). Outras correlações, com síndromes isoladas e um determinado antígeno, com padrões específicos de fluorescência no núcleo, no nucléolo, em células em estádios específicos de divisão e no citoplasma, deram margem a inúmeros estudos e a uma miríade de associações clínicas e imunológicas. 

É de extrema importância que o clínico reconheça não somente as associações clínicas de cada auto-anticorpo como também a sensibilidade e a especificidade do método utilizado para detectá-las. Recentemente foram desenvolvidas metodologias imunoenzimáticas (ELISA), que são suficientemente sensíveis para serem utilizadas como teste de triagem para anticorpos antinucleares.3 Estes testes são ainda mais sensíveis do que o esperado, e o número de falsos-positivos os torna confusos, e o seu alto custo, pelo menos nos tempos atuais, faz com que o seu uso ainda não seja recomendado na prática clínica. Foram distribuídos padrões entre os mais importantes laboratórios na América do Norte para auxiliar na padronização destes testes.4

Os exames, empregando outras técnicas mais quantitativas e específicas do que a imunofluorescência, tais como imunoprecipitação, hemaglutinação e Elisa, podem detectar as proteínas específicas às quais os auto-anticorpos reagem. Acreditamos que, por enquanto, o FAN com células HEp-2 terá, por pelo menos ainda algum tempo, devido ao seu baixo custo e a sua ampla sensibilidade, o seu papel garantido na pesquisa de doenças auto-imunes. A maior parte dos laboratórios, de pesquisa ou diagnóstico, utiliza as células HEp-2 como substrato anti-gênico do FAN, no entanto o resultado ainda é relatado com os padrões estabelecidos no imprint. O trabalho com células vivas reflete o controle de sua reprodução, fixação e permeabi-lização na lâmina, condições de arma-zenamento e transporte das mesmas, além de a técnica de imunofluorescência ser dependente de uma interpretação subjetiva de um obser-vador, sujeito às citadas variantes e à qualidade do próprio microscópio utilizado para a interpretação do teste.5

Numa iniciativa inédita, o I Encontro de Consenso Nacional para o Laudo do FAN HEp-2 teve como objetivo traçar protocolos para que os laboratórios de todo o país padronizem a preparação, interpretação e liberação do resultado do FAN. O grupo procurou contemporizar para minimizar as dificuldades e peculiaridades da interpretação, para dar o ponto de partida, homogeneizando, assim, a linguagem diagnóstica e abrindo uma nova perspectiva de pesquisas de associações clínicas e imunológicas.

Recomendações do I Consenso Nacional

Preparo das lâminas: As lâminas para a pesquisa do FAN com células HEp-2 devem ser obtidas de culturas que, ao serem plaqueadas, apresentaram-se em todos os estádios de evolução. O transporte e o armazenamento das lâminas devem ser condicionados em temperatura e umidade controladas. 
 
Condições do microscópio: O microscópio utilizado com adaptação para leitura de fluorescência deve estar em boas condições de manutenção e ter as lentes apropriadas para a liberação de exames de acordo com a recomendação do Consenso em todos os níveis. Para leitura ideal utilizam-se lentes de 40x e de 100x com óleo de imersão.
 
Diluições de triagem e titulação: A recomendação do Consenso orienta que a leitura deva ser feita inicialmente em soros diluídos 1/40 ou 1/80 (dependendo da qualidade do microscópio) em tampão fosfato. Uma vez fluorescente com um dos padrões abaixo, o soro deve ser diluído em 1/160 e 1/320. Caso a fluorescência seja ainda fortemente positiva em soro diluído em 1/320, recomenda-se que o resultado seja relatado como > 1/320; nas outras situações, relata-se o resultado como não-reagente, 1/80, 1/160 ou 1/320, de acordo com a última diluição apresentando fluorescência positiva.
O anticorpo anti-DNA de hélice dupla detectado em lâminas com Crithidia lucillae, cujo título tem valor preditivo em relação à atividade da nefrite do LES, deve ser diluido até o esgotamento.
 
Padrões: A recomendação do Consenso orienta que a leitura deva seguir a inspeção por etapas. Seguindo a ordem das quatro principais estruturas celulares, que podem se apresentar fluorescentes; algumas vezes há associação de padrões, ou padrões mistos, nestes casos, relata-se o laudo como reagente em duas ou mais estruturas.

A observação inicial é a do nucléolo e, sendo este fluorescente, o resultado é de padrão nucleolar (Quadro 2). Opcionalmente pode ser anotado se o aspecto da coloração é homogêneo (sem observação da mitose), aglomerado (com mitose amorfa) ou pontilhado (com observação da mitose); caso este não seja fluorescente, considera-se o nucléolo não-reagente, e parte-se para a segunda etapa da interpretação, que é a leitura do núcleo (Quadro 3). 

As doenças correlacionadas com os padrões nucleolares são a esclerodermia e as síndromes de superposição com características de esclerodermia. Os anticorpos mais comumente relacionados são anti-RNA polimerase I (4-6s) RNA e anti-DNA topoisomerase I (Scl-70) associados ao padrão nucleolar homogêneo, o antifibrilarina (U3-RNP) associado com o padrão nucleolar aglomerado e os anti-NOR-90 e anti-PM-Scl associados com o padrão nucleolar pontilhado.

Na fluorescência nuclear com células HEp-2, ao contrário do FAN com imprint, não se observa o padrão periférico isolado e, sim, a coloração homogênea acompanhada de coloração da membrana nuclear, que pode ser contínua ou pontilhada; o padrão contínuo de coloração da membrana nuclear está correlacionado com os anticorpos antilamina encontrados na doença hepática auto-imune crônica. O padrão homogêneo é observado com a mitose positiva, e o pontilhado, antes chamado de salpicado, pode se apresentar com mitose positiva no padrão centromérico ou fino denso; ou com a mitose negativa nos demais tipos de padrões pontilhados. O padrão homogêneo com a mitose positiva é o segundo tipo que deve ser relatado, este tem relação com os anticorpos anti-histonas, e podem ocorrer em várias doenças reumáticas auto-imunes e no lúpus induzido por drogas. É em relação ao padrão pontilhado que o maior número de observações adicionais foi incorporado (Quadro 3). Além do pontilhado que pode ser grosso, grosso reticulado ou fino, todos os três com a mitose ausente, podemos observar nas células HEp-2, ainda com a mitose ausente, o padrão pleomórfico, que ocorre pela combinação de especificidade contra mais de dois antígenos e com pontos isolados. Os pontos isolados podem ser contados e relatados como = 10 ou em número < 10, este tem relação com os anticorpos anti-p-80 coilina encontrados em 4% dos pacientes com a síndrome de Sjögren. Quando a mitose é observada (positiva), podemos encontrar o padrão centromérico ou o pontilhado fino.

A importância desta diferenciação se dá pela correlação detalhada entre os padrões de fluorescência e as especificidades imunológicas destes auto-anticorpos, assim como as suas associações com síndromes clínicas específicas. Algumas destas associações são bastante conhecidas, como a do padrão centromérico, encontrado em 70-80% dos pacientes com a síndrome de CREST.

Outros padrões sugerem uma especificidade que deve ser confirmada através de uma técnica mais sensível, como o pontilhado fino e o anticorpo anti-Ro/SSA. Os chamados PCNA (anticorpos contra antígenos nucleares de células em proliferação) são caracterizados pelo padrão nuclear pontilhado grosso em mais da metade das células e têm alta correlação específica com o diagnóstico de LES, sendo encontrados em cerca de 3% destes. Quando se observa a presença de fluorescência pontilhada em todo o núcleo, há sugestão de presença de anticorpos contra os antígenos extraíveis do núcleo (ENA). Anticorpos contra os ENA podem ser encontrados em várias doenças reumatológicas, como LES, esclerodermia, síndrome de Sjögren, artrite reumatóide e DMTC. O padrão pontilhado grosso sugere a presença de anticorpos anti-Sm ou anti-RNP: o primeiro com alta especificidade para LES e o segundo fortemente correlacionado com DMTC. O padrão pontilhado fino está relacionado com a presença de anticorpos anti-Ro/SSA, anti-La/SSB e também com o anti-Scl70, os dois primeiros podem ser encontrados na síndrome de Sjögren primária ou secundária, no LES cutâneo-subagudo e em crianças com bloqueio átrio-ventricular congênito ou eritema cutâneo fotossensível correlacionados à síndrome do lúpus neonatal.8, 9 Os anticorpos anti-Ro/SSA foram encontrados com maior freqüência na síndrome de Sjögren secundária, enquanto que a incidência de anti-La/SSB foi maior em pacientes com síndrome primária.10

A coloração do citoplasma, em tese, não deveria ser chamada de FAN, mas, uma vez que com as células HEp-2 podemos observar colorações do cito-plas-ma, é importante relatá-las (Quadro 4). Os anticorpos da dermato-polimiosite, anti-Jo1 (histidil-RNA sintetase) e anti-PM-Scl podem apresentar-se com coloração em antígenos encontrados no citoplasma. Anticorpos antimitocondriais, relacionados à cirrose biliar primária, produzem fluorescência pontilhada no citoplasma de células HEp-2. O padrão pontilhado com pontos isolados está relacionado com o anticorpo antilisossomial, que não tem significado clínico conhecido. O padrão citoplasmático fino denso tem relação com os anticorpos antiproteína P ribossomal, encontrados na psicose no paciente com LES, sendo visto em cerca de 10% dos pacientes com LES. A coloração citoplasmática fibrilar segmentar tem relação com o anticorpo contra o aparelho de Golgi, que pode ser encontrado em LES, artrite reumatóide e síndrome de Sjögren. 

O padrão de coloração do aparelho mitótico é o quarto tipo encontrado e que deve ser relatado de acordo com a estrutura observada com fluorescência (Quadro 5). O anticorpo contra o centríolo se apresenta com a observação de dois pontos nas extremidades do núcleo mitótico de células em divisão e um único nas células em repouso. Sua correlação clínica aparente é com a esclerodermia. O anticorpo contra a estrutura da ponte celular é identificado com a coloração na separação de duas células mitóticas, durante a telófase. Pode ser associado com esclerose sistêmica e outras formas clínicas de doenças do colágeno. O padrão fuso mitótico só aparece em células em mitose. É sugestivo de anticorpo contra duas proteínas, NuMA 1 e 2, associadas, respectivamente, com síndrome de Sjögren e LES.11

A importância de relatar outros tipos de padrões mais raros, e mesmo os aqui sugeridos, deverá ser revista e validada por vários centros. A iniciativa do grupo liderado pelo Laboratório de Auto-Imunidade da UCG teve apenas seu início na reunião de agosto de 2000, em Goiânia-GO. O grupo não é fechado e está disposto a discutir e divulgar o Consenso para todos os interessados. Foi elaborado um CD-rom, que pode ser obtido pelos laboratórios de patologia clínica, o qual servirá como um guia de interpretação e um atlas completo com as imagens de todos os padrões.

Com a interpretação do FAN HEp-2, de acordo com a recomendação do Consenso, algumas associações clínicas terão seu papel consolidado e outras deverão surgir. Cabe agora aos laboratórios a adoção das recomendações do Consenso; e aos clínicos e especialistas, que lidam com as doenças auto-imunes, o conhecimento da nova classi-ficação, permanecendo atentos, com o olhar clínico aguçado e em sincronia com o olhar científico e laboratorial. Há que se valorizar o relato de resultados capazes de influenciar a decisão clínica.12 O clínico deve conhecer as peculiaridades de cada metodologia empregada para detecção dos auto-anticorpos, sua sensibilidade e especificidade.13

Notavelmente alguns destes auto-anticorpos podem funcionar como instrumentos importantes para que os biologistas celulares elucidem estruturas subcelulares e determinem a função destes auto-antígenos. No futuro, poderemos esperar novos avanços para responder questões importantes, como: por que são estes os auto-antígenos? qual o seu impacto na patogênese das doenças auto-imunes?.1

Quadro 1 - Associações clínicas e especificidade de auto-anticorpos com padrões de FAN imprint de fígado de roedor

Padrão Associação clínica Auto-anticorpo associado
Periférico LES (nefrite) Anti-DNA de hélice dupla
Pontilhado ou salpicado LES, síndrome de Sjögren, DMTC Anti-ENA (Ro/SSA, La/SSB, Sm ou RNP)
Nucleolar Esclerose sistêmica Anti-Scl70 e outras enzimas nucleolares
Homogêneo LES e LE induzido por droga Anti-histona(s)

 
Quadro 2 -Tipos de padrão nuclear, o primeiro a ser observado na interpretação do FAN HEp-2

FAN Nucleolar

Obrigatório Opcional Informação adicional
Nucleolar Homogêneo Mitose negativa
Aglomerado Mitose amorfa
Pontilhado Mitose positiva
Nucléolo não-reagente - -

 
Quadro 3 - Tipos de padrão nuclear, que apresenta relação com uma série de auto-anticorpos encontrados em doenças do colágeno e outras doenças autoimunes sistêmicas e órgão-específicas

FAN Nuclear

Obrigatório Opcional Informação Adicional
Membrana nuclear Contínua Homogêneo periférico
Pontilhada com mitose negativa
Homogêneo   Mitose positiva
Pontilhado Grosso Mitose negativa
Grosso reticulado Mitose negativa
Fino Mitose negativa
Pleomórfico - Mitose negativa
Pontos 10 Mitose negativa
< 10 Mitose negativa
Pontilhado Fino Mitose positiva
Centromérico - Mitose positiva
Núcleo não-reagente teste - -

 
Quadro 4 - O citoplasma pode estar fluorescente em padrões distintos de disposição e distribuição

Citoplasmático

Obrigatório Opcional
Fibrilar Linear
Filamentar
Segmentar
Pontilhado Com pontos isolados
Fino
Fino denso
Reticulado
Pontilhado polar  
Citoplasma não-reagente  

 
Quadro 5 - Tipos de padrão de fluorescência do aparelho mitótico, que só é observado no FAN HEp-2

Aparelho Mitótico

Obrigatório Opcional
Citoplasma não-reagente  
Centríolo  
Ponte intercelular  
Fuso NuMA1
NuMA2

Referências
1. Hiepe, F.; Dorner, T. & Burmester, G. Antinuclear antibody and extractable nuclear antigen-related diseases. Int. Arch. Allergy Immunol., 123: 5-9, 2000.
2. Cook, L. New methods for detection of antinuclear antibodies. Clin. Immunol. Immunopathol., 88: 211-20, 1998.
3. Tan, E.N.; Smolen, J.S. & McDougal, J.S. et al. A critical evaluation of enzyme immunoassays for detection of anti-nuclear autoantibodies of defined guidelines for clinical use of the anti-nuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arthritis Rheum., 42: 455-64, 1999.
4. James, K.; Carpenter, A.B.; & Cook, L. et al. Development of the antinuclear and anticytoplasmic antibody consensus panel by the Association of Medical Laboratory Immunologists. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7: 436-43, 2000.
5. Nakamura, R.M., Ivor, L. & Hannon, W.H. et al. Quality assurance for indirect immunofluorescent test for autoan-tibodies to nuclear antigens (IF-ANA) approved guideline. NCCLS, 16: 1-15, 1996.
6. Craft, J. & Hardin, J. Anti-snRNP antibo-dies. Rheum. Dis. North Am., 18: 311-15, 1992.
7. Hietarinta, M. & Lassila, O. Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann. Int. Med., 28: 283-91, 1996.
8. Hang, L. & Nakamura, R.M. Current concepts and advances in clinical laboratory testing for autoimmune diseases. Clin. Rev. Lab. Sciences, 34: 275-311, 1997.
9. Scofield, R.H.; Farris, A.D.; Horsfall, A.C. & Harley, J.B. Fine specificity of the autoimmune response to the Ro/SSA and La/SSB ribonucleoproteins. Arthritis Rheum., 42: 199-209, 1999.
10. Miyawaki, S. Autoantibodies in patients with Sjogren's syndrome and their clinical significance. Nippon Rinsho, 53: 2422-428, 1995.
11. Rattner, J.B.; Mack, G.J. & Fritzler, M.J. Autoantibodies to components of the mitotic apparatus. Mol. Biol. Rep., 25: 143-55, 1998.
12. Kavanaugh, A.; Tomar, R.; Reveille, J.; Solomon, D.H. & Homburger, H.A. Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Arch. Pathol. Lab. Med., 124: 71-81, 2000.
13. Wanchu, A. Antinuclear antibodies: clinical applications. J. Postgrad Med., 46: 144-48, 2000.